溃疡性结肠炎（ulcerative colitis ，UC ）是一种肠道非特异性、慢性、复发性、炎症性疾病，主要特征为结肠黏膜上皮损伤和肠道内稳态破坏，表现为体质量减轻、腹痛、带血黏液腹泻、直肠萎缩，严重影响患者生活品质，UC 在我国患病率逐年增加 [1] 。目前常用的UC 治疗药物包括氨基水杨酸盐、和免疫抑制剂 [2] ，然而，这些药物往往伴随着不良反应，且部分患者仍需要手术，因此，迫切地需要开发安全有效的防治UC 的药物。

  白术具有健脾益气、燥湿利水的功效，用于脾虚食少、腹胀泄泻等有近数千年历史，其主治证候与 UC 一致，动物实验证明白术具有抗 UC 的作用 [3] 。白术作为一种重要的补益类中药，多糖是其重要活性成分，主要由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖和半乳糖等组成 [4] 。UC 发病机制复杂，具有定性定量准确、覆盖面广、灵敏度较高、高通量等优点的非靶向代谢组学检测技术为从整体上揭示药物作用机制提供了可能。故本研究在证实白术多糖具有抗UC 作用的基础上，进一步采用代谢组学技术探讨其对UC 的作用机制，为白术多糖用于UC 防治提供理论和实践基础。

  SPF 级雄性BALB/c 小鼠72 只，8 周龄，体质质量18 ～22 g ，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK （湘）2019-0004 。动物饲养于温度22 ～24 ℃、相对湿度50% ～60% 的屏障环境中，12 h 光照/ 黑暗交替，自由进食饮水，适应性饲养7 d 。动物实验经江西中医药大学动物实验科技中心伦理委员会批准（批准号JZLLSC20230350 ）。

  白术饮片（批号04 ）产地为安徽省鹿邑县郑集市，经江西中医药大学张寿文教授鉴定为菊科植物白术 Atractylodes macrocephala Koidz. 的干燥根茎。

  TripleTOF5600 型高分辨飞行时间质谱联用仪（美国AB SCIEX 公司）；BAS124S 型电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；Tecan Spark 多功能酶标仪（南昌树森实业有限公司）；PLUS-E2-10TH 型实验室级超纯水机（南京易普易达科技发展有限公司）；真空干燥箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；KQ5200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

  取白术饮片100 g ，粉碎，加10 倍量蒸馏水，回流提取3 次，每次2 h ，趁热滤过，合并滤液，减压浓缩至含生药0.2 g/mL ，乙醇醇沉，醇沉终体积分数为80% ，4 ℃静置24 h 后真空抽滤，依次用无水乙醇- 丙酮- 石油醚（60 ～90 ℃）- 无水乙醇洗涤沉淀，挥干有机试剂得淡黄色白术粗多糖。白术粗多糖用 100 mL 蒸馏水溶解，并与 Sevage 试剂（氯仿 - 正丁醇4∶1 ）按1∶3 混合搅拌25 min ，4000 r/min 离心10 min ，重复多次，直至无蛋白沉淀物。将上清液转移到透析袋（截留相对分子质量8000 ～14 000 ）中，分别在自来水、双蒸水中各透析24 h ，透析过程中每隔2 h 换水。透析结束后进行冷冻干燥，最终得到白色粉末状白术多糖，采用相同的方法制备3 次，共得到白术多糖12.78 g 。

  2.2.1 葡萄糖标准曲线 ℃干燥至恒定质量的无水葡萄糖标准品10 mg ，蒸馏水溶解并定容至100 mL ，得到质量浓度为0.1 mg/mL 的葡萄糖标准溶液。精密量取无水葡萄糖标准溶液0.2 、0.4 、0.6 、0.8 、1.0 、1.2 mL ，分别置于具塞试管中加水至2 mL ，各精密加入5% 苯酚溶液1 mL ，摇匀，迅速加入浓硫酸5 mL ，摇匀，放置10 min ，置40 ℃水浴保温15 min ，取出后冰水浴10 min ，放置室温作为样品。以水经过相同处理后为空白对照，用紫外- 可见分光光度计在490 nm 波长处测定吸光度（ A ）值，以葡葡萄糖含量为横坐标（ x ），以 A 490 值为纵坐标（ y ），绘制标准曲线 多糖含量的测定 精密称取干燥多糖样品5 mg ，蒸馏水定容至100 mL 量瓶中，采用苯酚- 硫酸法，移取白术多糖溶液0.8 mL ，按照“2.2.1 ”项下方法操作，用紫外- 分光光度计在490 nm 波长处测定，平行3 次，取平均值，测得 A 值，带入标准曲线的回归方程，计算总糖含量。

  BALB/c 小鼠适应性喂养7 d 后，随机分为对照组、模型组及白术多糖低、中、高剂量（60 、100 、200 mg/kg ）组和美沙拉嗪（300 mg/kg ）组，实验组每组 12 只。对照组每日饮用蒸馏水，其余组连续 12 d 自由饮用2.5% DSS 溶液。从造模第1 天起，各给药组ig 相应药物（20 mL/kg ），对照组和模型组ig 等体积蒸馏水，1 次/d ，连续12 d 。

  ，DAI）评分测定每日记录小鼠体质量、精神活动状态、毛发光泽、大便性状和便血情况，进行DAI 评分 [5] ，评分标准见表1 。

  末次给药后，小鼠禁食不禁水12 h ，摘眼球取血于抗凝管中，3500 r/min （离心半径10 cm ）离心15 min ，取上清液， −80 ℃保存备用。按试剂盒说明书检测血清中TNF-α 、IL-10 水平及SOD 、MPO 活性。

  小鼠给予安乐死，迅速取出结肠，称定质量并记录结肠长度，经固定、脱水、包埋、切片、HE 染色后封片，于显微镜下观察并拍照。

  采用苯酚硫酸法检测白术多糖的总糖含量，标准曲线 ，计算得到白术多糖质量分数为75.9% 。

  小鼠体质量变化率、DAI评分和结肠长度的影响实验期间，对照组小鼠状态良好；模型组小鼠毛色暗淡，出现懒动、血便、稀便等状况。经美沙拉嗪及白术多糖干预后，UC 小鼠上述状况均有所改善。如图1 所示，与对照组比较，模型组小鼠体质量明显降低（ P ＜0.01 ），DAI 评分非常明显升高（ P ＜0.01 ），结肠长度显著缩短（ P ＜0.01 ）；与模型组比较，美沙拉嗪组小鼠体质量非常明显升高（ P ＜0.01 ），DAI 评分明显降低（ P ＜0.01 ），结肠长度明显地增加（ P ＜0.01 ）；白术多糖各剂量组小鼠体质量均非常明显升高（ P ＜0.05 ），白术多糖中、高剂量组小鼠DAI 评分均明显降低（ P ＜0.05 、0.01 ），结肠长度均明显地增加（ P ＜0.01 ）。

  小鼠血清中炎症因子及氧化应激指标的影响如图2 所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中MPO 活性和TNF-α 水平均非常明显升高（ P ＜0.01 ），SOD 活性和IL-10 水平均明显降低（ P ＜0.01 ）；与模型组比较，各给药组小鼠血清中MPO 活性和TNF-α 水平均明显降低（ P ＜0.05 、0.01 ），SOD 活性和IL-10 水平均非常明显升高（ P ＜0.05 、0.01 ）。

  小鼠结肠组织病理变化的影响如图3 所示，模型组小鼠结肠黏膜可见溃疡，隐窝消失，杯状细胞溶解，并伴有大量炎性细胞浸润；白术多糖中剂量组黏膜充血，但杯状细胞结构较为完整；美沙拉嗪组及白术多糖高、低剂量组小鼠结肠黏膜未见溃疡及充血，炎性细胞浸润减少，炎症得到改善。

  小鼠血清代谢组学的影响3.5.1 血清代谢图谱 应用UPLC-Q-TOF/MS 进行血清样品的分离和数据采集，得到各组小鼠血清代谢图谱（图4 ），各组样品总离子流图基本相似，但各组峰形及峰面积存在一定差别，表明小鼠体内部分代谢物发生变化。

  3.5.2 代谢轮廓分析 采用PCA 分别对血清的代谢轮廓做多元化的分析，结果见图5 。各组样本聚集在95% 的置信区间内，分为 3 类，其中对照组、美沙拉嗪组和白术多糖高、低剂量组为 1 类，模型组为 1 类，白术多糖中剂量组为一类，分离程度较高，说明 3 组代谢物组间差异较大。经 DSS 诱导后，模型组独自位于一侧，提示代谢物的种类或水平发生了显著变化；给予药物干预后，白术多糖高、低剂量组及美沙拉嗪组明显向对照组靠近。白术多糖中剂量组被分为另外一类，但和模型组还是存在很明显的分类差别，说明白术多糖中剂量组也对 DSS 诱导的小鼠存在治疗作用，只是和白术多糖高、低剂量组表达程度不同，代谢轮廓结果与体质量变化率、炎症因子测定和病理切片的结果相呼应，说明给药无量效关系。

  3.5.3 OPLS-DA 在PCA 的基础上进行OPLS-DA ，模型组与各给药组完全分离，为防止模型出现过拟合，对模型进行200 次随机置换检验，血清样品的 Q 2 所在回归线与 Y 轴的截距均小于0 ，表明模型质量良好。S-plot 载荷图能够鉴定出导致组间差异的代谢物，图中的点距离原点越远，表明此化合物对分组的影响越大，Scatter 图综合了VIP 值，其离原点越远，表明此化合物为显著的差异代谢物，二者可以同时表征血清组间的差异代谢物（图6 ）。

  3.5.4 差异代谢物的鉴定 根据峰面积、FC 及 P 值构建火山图，见图7 ，根据VIP ＞1 筛选出差异代谢物，再根据文献及HMDB 数据库在小鼠血清中鉴定出59 个差异代谢物，见表2 。

  3.5.5 代谢通路分析 将获得的差异代谢物导入MetaboAnalyst 5.0 进行通路分析，结果见图8 ，以impact ＞0.1 、 P ＜0.05 为目标，筛选出与白术多糖干预UC 小鼠相关通路，影响最强的分别为α- 亚麻酸代谢通路、类固醇激素生物合成通路、初级胆汁酸生物合成通路、甘油磷脂代谢、泛酸和辅酶A 生物合成通路、不饱和脂肪酸的生物合成通路。

  小鼠血清氧化应激的影响炎症反应和氧化应激是UC 发展的主要的因素，在结肠炎症区域，由于炎症介质的增多和抗炎因子的减少[6] ，一方面，会刺激机体产生和释放大量活性氧；另一方面又会使清除自由基的SOD 等酶活性降低，两者均会使活性氧不间断地积累，从而引起结肠组织的损伤，这是UC 的一种潜在致病因素[7] 。MPO 是单核细胞和中性粒细胞的一种成分，可产生高水平的活性氧。MPO 在临床上常被用作观察中性粒细胞浸润到肠黏膜的标志物[8] 。本研究结果为，白术多糖能够明显降低UC 小鼠MPO 活性，提高SOD 活性，表明抗氧化损伤是白术多糖防治UC 的机制之一。

  小鼠血清炎性因子的影响TNF-α 是一种由巨噬细胞、淋巴细胞和嗜中性粒细胞等多种细胞分泌的强促炎细胞因子，可促进氧氮介质释放，或直接激发上皮- 间质转化，促使上皮细胞恶变，在细胞增殖、分化和凋亡中起及其重要的作用 [9] 。IL-10 是由Treg 细胞、Th2 细胞、肠道上皮细胞、巨噬细胞等多种细胞分泌的抑炎因子 [10] ，本研究根据结果得出白术多糖能够显著抑制UC 小鼠血清中TNF-α 水平，并显著提升抗炎因子IL-10 水平，抑制机体的炎症反应，因此，调节抗炎与促炎因子的平衡，可能是白术多糖防治UC 的又一机制。

  小鼠血清代谢产物及代谢通路的影响基于UHPLC-Q-TOF-MS 对UC 小鼠血清样本做代谢组学分析，在样本中鉴定得到59 个差异代谢物，最重要的包含7 种脂肪酸衍生物、3 种胆汁酸、4 种类固醇脂质分子、7 种不饱和脂肪酸、12 种酰基肉碱、9 种溶血磷脂酰胆碱、5 种溶血磷脂酰乙醇胺和其他化合物。与对照组比较，模型组 59 种代谢物均异常表达，提示 UC 小鼠体内代谢水平紊乱；经白术多糖以及美沙拉嗪干预后，发生改变的代谢物水平均有不同程度的回调，主要涉及 α- 亚麻酸代谢通路、类固醇激素生物合成通路、初级胆汁酸生物合成通路、甘油磷脂代谢、泛酸和辅酶 A 生物合成通路、不饱和脂肪酸的生物合成通路等代谢通路。通过对比模型组和白术多糖给药组的代谢物水平，发现白术多糖给药后小鼠血清代谢物水平整体趋向于对照组和美沙拉嗪组，提示白术多糖与美沙拉嗪类似，可能通过改善相关代谢过程，发挥治疗 UC 的作用。

  小鼠血清代谢产物及代谢通路与表型的关系磷脂酰胆碱（ phosphatidylcholines ， PC ）和磷脂酰乙醇胺（ phosphatidylethanolamine ， PE ）等甘油磷脂是生物膜的主要脂质成分，在维持膜结构、保证膜结合蛋白、离子通道和受体的正常运作过程中发挥及其重要的作用，由不同长度和饱和度的脂肪酸组合而成 [11-12] ，在肠炎过程中常发生甘油磷脂代谢异常 [13-14] 。PC 在磷脂酶A2 作用下水解产生溶血磷脂酰胆碱 [15] 。溶血磷脂酰胆碱作为趋化介质，可通过特异性G 蛋白偶联受体对免疫细胞活化的修饰从而参与炎症过程 [16] 。溶血磷脂酰胆碱含量过高时会对细胞膜造成损伤，进一步导致磷脂代谢紊乱 [17] ，并进一步损伤细胞膜，因此导致组织损伤。由于甘油磷脂的C-2 通常连接不饱和脂肪酸，因此，甘油磷脂在磷脂酶A2 的作用下导致溶血磷脂增加的同时，也会导致不饱和脂肪酸增加。本研究之后发现，与对照组比较，模型组不饱和脂肪酸、溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺差异代谢物表达均升高，而白术多糖给药后其含量显著下调，提示白术多糖可通过调节甘油磷脂和不饱和脂肪酸代谢，减轻细胞膜损伤，稳定细胞结构，增强结肠的屏障功能，从而改善UC 小鼠的体质量变化率、DAI 评分、结肠长度和结肠组织病理变化等表型。

  类固醇激素和初级胆汁酸合成途径从胆固醇开始，本研究中模型组19- 去甲雄甾酮、硫酸表雄酮、醛固酮等4 种类固醇代谢物以及考胆酸、3α,7α- 二羟基考前列烷酸、10- 氧代十八烷酸3 种胆汁酸代谢物显著上调。类固醇激素通过与特定的细胞内受体相结合，通过刺激核因子-κB （nuclear factor-κB ，NF-κB ）等多种信号转导途径[18] 来促进TNF-α 的形成，抑制IL-10 的形成，从而促进炎症发生；胆汁酸代谢紊乱在肠道炎症中起着及其重要的作用[19] ，可激活与NF-κB 信号通路紧密关联的法尼醇X 受体（farnesoid X receptor ，FXR ）[20-21] 。NF-κB 调节免疫和炎症反应，可诱导TNF-α 的生成[22] 。TNF 不但可以诱导炎症介质的表达，还可触发细胞死亡，调控炎症性疾病的发病机制[23] 。本研究根据结果得出，给予白术多糖后，以上代谢产物均回调，提示白术多糖可通过调节类固醇激素和初级胆汁酸生物合成通路抑制NF-κB 途径，调节抑炎与促炎因子的平衡，减少炎症细胞损伤，从而改善UC 。

  中药量效关系仍处于经验积累阶段 [24] ，白术多糖高、中、低剂量组在防治DSS 诱导的UC 均有明显的效果，但是白术多糖不同剂量组在体质量变化率、DAI 评分、结肠长度、氧化应激、病理损伤、和代谢组学分类结果方面没有显示出明显的剂量相关性，白术多糖中剂量组代谢轮廓结果与体质量变化率、DAI 评分和氧化应激等表型结果相呼应，提示白术多糖给药不存在很明显的量效关系。

  综上，白术多糖能够最终靠调节内源性代谢产物来平衡促炎因子与抗炎因子，增强抗氧化和调控脂质、类固醇等相关代谢通路，从而干预UC 的发展，为 多糖用药的开发提供了理论依据。

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